Accueil Site » Retour liste annuaire » plateforme : GENTYANE

GENTYANE
Responsable : Poncet Charles • Responsable Tech. : Poncet Charles
Adresse : Génétique, Diversité et Ecophysiologie des Céréales
5 chemin de Beaulieu
63039 Clermont-Ferrand

complements

Certifications

  

Site web

http://gentyane.clermont.inra.fr

Presentation de la plate-forme

1- Spécificité scientifique de la plate-forme :
Durant les dix dernières années, l’explosion des technologies de génomique chez toutes les espèces a conduit au développement de nombreux outils permettant une meilleure compréhension des phénomènes biologiques qui contrôlent le fonctionnement d’un organisme. Les marqueurs moléculaires en particulier ont largement contribué à l’identification de gènes essentiels et leur exploitation intensive en diagnostic est maintenant largement répandue. Cependant, si les efforts menés au niveau international se sont concrétisés par le développement de millions de marqueurs chez certaines espèces comme l’humain ou plus largement les mammifères, chez les végétaux, le nombre de marqueurs est resté plus restreint (seulement quelques dizaines chez certaines espèces). De plus, l’accroissement du nombre de données de séquençage a favorisé le développement de certains types de marqueurs chez les mammifères (Single Nucleotide Polymorphism SNP) au détriment d’autres (microsatellites ou Simple Sequence Repeat SSR) qui demeurent largement utilisés chez les plantes. Néanmoins, les deux genres se rejoignent sur certains points, en particulier sur une nécessité d’analyser des zones communes (allant du gène à plusieurs mégabases (Mb)) chez un nombre plus ou moins important d’individus. Il est donc crucial de mettre en place des technologies permettant d’atteindre cet objectif. Finalement, le nombre croissant de marqueurs impose de réfléchir sur de nouvelles stratégies de détection, en particulier en utilisant les possibilités offertes par les puces sur lesquelles plusieurs milliers (voire millions) de sondes peuvent être mises simultanément.

C’est la capacité à satisfaire ces trois enjeux qui fait aujourd’hui la spécificité scientifique de la plate-forme GENTYANE qui apporte une réponse : (1) à la fois aux besoins de génotypage d’espèces pour lesquelles l’information de marquage est étendue (humain, mammifères) avec des technologies adaptées (séquençage allélique, génotypage de SNP) et pour des espèces disposant de stocks de marqueurs plus limités (microsatellites, quelques SNP) ; (2) aux besoins actuels de dé-complexification des génomes chez toutes les espèces pour un re-séquençage spécifique de certaines régions d’intérêt (capture de séquence et séquençage haut débit) ; (3) en terme de développement des technologies innovantes de génotypage très haut débit sur puce (Insertion Site Based Polymorphism : ISBP).
De plus, son intégration dans un réseau national lui permet de proposer dans certains cas une gamme de services plus étendue en utilisant des outils disponibles par ailleurs et une possibilité de faire sauter des goulots d’étranglement dans les périodes de forte activité.

2- Systèmes biologiques
La plate-forme GENTYANE rassemble deux unités, l’une travaillant sur l’Humain (Centre Jean Perrin, plate-forme GINA) et l’autre dans le domaine végétal (INRA, plate-forme GENAP). L’intégration du site de Jean Perrin au sein de la plate-forme étant récente, celui-ci n\'a traité que des échantillons humains jusqu\'à présent. Néanmoins, ses responsables ont affiché une volonté claire d’ouvrir leur activité à d’autres systèmes biologiques et les premiers projets végétaux ont démarré sur ce plateau.
Au niveau du site INRA, l’éventail est plus étendu. Parce qu’historiquement, la majorité des développements de marqueurs et de techniques a été faite sur le blé tendre, cette espèce est encore beaucoup travaillée (30% de l’activité annuelle sur la période 2008-2012). Néanmoins, à la suite de la mise en place du réseau des plates-formes et de l\'appel d\'offre annuel de génotypage, celle-ci a montré sa capacité à prendre en charge des programmes sur d\'autres espèces non travaillées jusque là. Depuis 2006, d’autres plantes de grande culture telles que le colza, le tournesol et le maïs sont étudiées. De plus, depuis début 2008, nous sommes en collaboration avec d’autres unités, dans des programmes sur le pois, le ray-grass, le pommier, le cerisier, la pomme de terre, le melon, Medicago et le puceron. Des collaborations ont également été conduites avec des laboratoires privés sur le caféier et le cacaoyer (Nestlé), sur le rosier (Delbard) et sur l\'orge (Pernod Ricard). Cet éventail ne reste pas restrictif et la plate-forme est ouverte à tout type de matériel végétal ou animal pour demandeurs public ou privé.

3- Méthodes
La plate-forme GENTYANE maîtrise les techniques essentielles permettant le génotypage à moyen et haut débit par typage d’amplicons ou par re-séquençage d’allèles. La capacité de prise en charge annuelle est variable en fonction des prestations proposées, les différentes technologies se partageant les mêmes automates (thermocycleurs, robots, séquenceurs capillaires, PCR quantitative) avec des temps d’utilisation machine très variables d’une prestation à l’autre. Par exemple, sur PCR Quantitative Light Cycler 480 Roche, elle varie de 3,75 millions d’analyses par an si seuls des projets de génotypage SNP étaient réalisés, à 1 million d’analyses par an s’il n’y avait que des projets de détection d’ISBP. Les méthodes utilisées et les capacités maximales sont les suivantes (sur une base de 250 jours ouvrés/an) :

o Génotypage Microsatellites (SSR) (actuellement 10% de l’activité de la plate-forme) : sur séquenceur capillaire ABI3730 XL, au maximum ~18 500 analyses/jour soit 4,60 millions de points par an ;

o Génotypage de SNP (actuellement 80% de l’activité de la plate-forme) : pour ce faire, différentes technologies sont utilisées sur la plate-forme : Chimie Kaspar sur PCR quantitative LC480 ou Microfluidique Biomark Fluidigm, au maximum ~60 000 analyses/jour soit 12 millions de points par an ; système Genetitan Affymetrix Axiom avec au maximum ~5*384/96 analyses/semaine soit 317 millions de points par semaine ; par re-séquençage d’allèles sur Illumina MiSeq ~60 runs de séquençage/an.

La capacité actuelle est suffisante pour absorber la totalité des projets soumis à la plate-forme. Les délais d’accès sont fonctions de la taille des projets et des pics d’activité annuelle : ils peuvent varier de quelques jours à quelques mois.

4- Prestations offertes
Pour réaliser les projets, différentes prestations sont proposées : (1) la totalité de l’expérimentation peut être menée par le personnel de la plate-forme si le programme est de taille raisonnable ou par un CDD recruté sur contrat si le nombre de données à produire est important. Dans les deux cas, les résultats bruts et finaux (après interprétation) sont fournis au demandeur dans le format défini au début du projet (tableau, texte, figures…) ; (2) l’expérimentation peut être menée par un personnel de l’équipe proposante accueilli sur le site. Dans ce cas, la personne a accès aux appareils et aux modes opératoires et une formation est dispensée au démarrage du projet. Elle a alors en charge l’analyse des données et peut utiliser toutes les facilités de l’unité pour les mettre au format désiré ; (3) pour les projets de séquençage allélique sur séquenceur MiSeq Illumina, les projets externes sont conduits soit sur le site du Centre Jean Perrin (CJP) soit sur le site de l\'INRA (GS-Junior) par son personnel car il est actuellement le seul habilité à y opérer. Cependant, pour les projets importants, si l’équipement le permet et après formation, le laboratoire demandeur peut réaliser certaines étapes du protocole dans ses propres locaux. Le nombre et la nature des étapes sont le résultat d’un accord préalable. Le chargement des produits sur le séquenceur reste de la responsabilité du personnel de la plateforme. En revanche, l’analyse des données de séquençage peut être réalisée dans le laboratoire demandeur.

5- Plate-forme multi sites
La plate-forme GENTYANE est localisée sur deux sites distants de moins de cinq kilomètres avec des connections routières aisées (environ 6 minutes de trajet en voiture). Le site du Centre Jean Perrin (58 rue Montalembert 63000 Clermont-Ferrand) est localisé à proximité du CHU et les outils de génotypage sont localisés dans le Laboratoire d’Oncogénétique Moléculaire (responsable Yves-Jean Bignon). Le site INRA est localisé en périphérie de l’agglomération clermontoise (5 chemin de Beaulieu, 63039 Clermont-Ferrand cedex2) et la plate-forme est installée dans les locaux de l’UMR1095 Génétique, Diversité et Ecophysiologie des Céréales (responsable Thierry Langin).

Moyens et equipements

L’activité historique de la plate-forme consiste en la réalisation de génotypage de marqueurs moléculaires (SNP, SSR). Grâce au support d'IBiSA, cette activité évolue progressivement vers le séquençage systématique et à haut débit. L’équipement est constitué de : (1) 1 appareil d’électrophorèse capillaire de type ABI3730XL (1 appareil, acquis en octobre 2008) permettant entre autre la séparation de fragments (SSR); (2) 1 machine de PCR quantitative LightCycler 480 Roche (2010), permettant le HRM et l’analyse d’ISBP par courbe de dissociation; (3) une PCR quantitative en microfluidique Fluidigm Biomark associée au système JUNO (2015) permettant des études d'expression et du génotypage SNP en chimie Kaspar; (4) deux robots Hamilton (ML STAR96 + 8, Starlet 8, septembre 2008), 4 robots Beckman Coulter ( 4 Biomeck FXP dual (8, 96 et 384), Biomeck 4000) pour la préparation de tous les échantillons avant génotypage, (5) un système de fragmentation d'ADN Covaris M220, (6) un système de lecture automatisée d'acide nucléique et quantification TapeStation Agilent, (7) un appareil de génotypage SNP (par hybridation) ultra haut débit Affymetrix Axiom Genetitan robotisé, (8) un séquenceur NGS Illumina MiSeq, (9) un séquenceur NGS Long Reads Pacific Biosciences Sequel permettant le séquençage de fragment de taille comprise entre 10kb jusqu'à 80kb (5 à 10 Gb par run), (10) un robot d'extraction d'ADN Oktopure LGC Genomics en bille magnétique Sbeadex permettant l'extraction de 1600 ADNs par jour (plante et animal).

Galerie