CRYOEM

Observation d’objets biologiques (protéines et assemblages multiprotéiques) dans leur milieu aqueux naturel et détermination de leur structure à une résolution d’environ un nanomètre.

Site de la plateforme

CRYOEM

Observation d’objets biologiques (protéines et assemblages multiprotéiques) dans leur milieu aqueux naturel et détermination de leur structure à une résolution d’environ un nanomètre.

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La plateforme CRYOEM permet l’observation d’objets biologiques (protéines, complexes multiprotéiques, virus, liposomes, assemblages multimoléculaires...) après coloration négative ou par cryo-microscopie électronique dans leur milieu aqueux naturel.

La coloration négative permet de vérifier la qualité et l’homogénéité des échantillons, d’avoir une idée de la forme des objets et de déterminer la stœchiométrie de certains assemblages. L’acquisition d’images par cryo-microscopie électronique à moyenne résolution (8 à 12 Å) sur le FEI Tecnai G20 et les moyens de calcul disponibles sur la plateforme permettent de résoudre des structures à moyenne résolution, donnant accès à des microscopes plus puissants, comme le 300 kV Titan Krios, qui fournit des résolutions atomiques.

La plateforme CRYOEM permet aussi l’observation de complexes in situ (protéines à la surface d'organites purifiés ou de virus enveloppés, protéines membranaires reconstituées dans des liposomes...) par cryo-tomographie électronique.

Expertises et services

Observation d’échantillons biologiques (protéines, complexes multiprotéiques, virus, liposomes, assemblages multimoléculaires...) après coloration négative ou par cryo-microscopie électronique,
Détermination de structures 3D à partir d’images obtenues par cryo-microscopie électronique à moyenne résolution (8 à 12 Å),
Observation de complexes in situ par cryo-tomographie électronique,
Vitrification d’échantillons pour leur observation par cryo-microscopie électronique.

Moyens et équipements

Environnement L2 permettant la manipulation de pathogènes et notamment de virus,
Microscope FEI Tecnai G20, 200 kV avec FEG (field emission gun) adapté à la cryo-tomographie, acquis en 2008 et équipé en 2014 d'une caméra à comptage d'électrons en détection directe (Gatan K2 Summit),
Microscope FEI Tecnai Spirit 120 kV avec filament LaB6, acquis en 2014 et équipé d'une caméra à comptage d'électrons en détection directe (Gatan K2 Base),
Porte-objet refroidi Gatan 626 pour le transfert à froid et la mesure à basse température d’échantillons congelés-hydratés, sensibles au faisceau d'électrons,
Vitrobot Mark IV automatisé pour la vitrification (plunge-freezing) d’échantillons aqueux avec contrôle des paramètres critiques (température, humidité, force et temps de blot),
Système d’effluvage (ELMO).

<hr>Microscope 200 kV Tecnai FEI équipé d’un FEG.

<hr>Reconstruction 3D d’un complexe protéique. La structure atomique de la protéine, déterminée par radiocristallographie, a été insérée dans la carte de densité obtenue par cryo-microscopie électronique (> 4 Å).

Comment soumettre un projet ?

Les demandes peuvent être envoyées par mail tout au long de l’année au responsable scientifique de la plateforme, Yves Gaudin. Elles sont examinées et sélectionnées par un conseil scientifique qui se réunit régulièrement. Le délai de réponse est d’environ un mois, mais si nécessaire, il peut être réduit à quelques jours. Les projets sont sélectionnés sur la base de leur mérite et de leur faisabilité, y compris en termes de temps et de ressources humaines à consacrer.

Exemple d'utilisation

Etude de l’auto-assemblage d’une protéine de l’enveloppe nucléaire

Sophie Zinn-Justin co-dirige l’équipe « Enveloppe nucléaire, télomères et réparation de l’ADN » à l’Institut de biologie intégrative de la cellule (I2BC). Elle a contacté Ana Andreea Arteni, responsable technique de CRYOEM pour caractériser le processus d’auto-assemblage de la région nucléoplasmique d’une protéine de l’enveloppe nucléaire interne, l’émerine, mutée dans certaines maladies génétiques. La région nucléoplasmique de l’émerine interagit avec le nucléosquelette, des protéines associées à la chromatine et des enzymes des voies de signalisation. Elle est capable de s’auto-assembler, régulant ainsi ses propriétés de liaison.

Dans cette étude, les résultats de la plateforme ont montré que la région nucléoplasmique de l’émerine forme des filaments d’un diamètre de 10 nanomètres. Une mutation associée à des défauts cardiaques et déstabilisant le domaine N-terminal de l’émerine accélère la formation de ces filaments. De plus, seule la forme auto-assemblée de l’émerine est capable d’interagir directement avec le nucléosquelette. Sa forme monomérique interagit aussi avec le nucléosquelette, mais par l’intermédiaire de la protéine BAF associée à la chromatine.

Pour en savoir plus : C. Samson et al. (2018). Structural analysis of the ternary complex between lamin A/C, BAF and emerin identifies an interface disrupted in autosomal recessive progeroid diseases., Nucleic Acids Research, 46:10460-10473.

Contact

CRYOEM
Institut de biologie intégrative de la cellule (I2BC)
1 avenue de la Terrasse
91198 Gif-sur-Yvette
Région : Île-de-France+ 33 (0)1 69 82 38 56
yves.gaudin@i2bc.paris-saclay.fr
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