Plateforme protéomique de Paris 5 (3P5)

Un accès à des méthodes de pointe et une expertise de haut niveau pour l’analyse protéomique quantitative, globale ou ciblée, par des méthodes séparatives couplées à la spectrométrie de masse.

Site de la plateforme

Plateforme protéomique de Paris 5 (3P5)

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Plateforme protéomique de Paris 5 (3P5)

La plateforme 3P5 met à disposition son expertise dans l’analyse protéomique quantitative globale. Elle a développé des méthodes pour la quantification absolue des protéines à haut débit, qu’elle est aujourd’hui la seule à proposer en tant que plateforme.

3P5 prend en charge in extenso les analyses qui lui sont confiées, depuis la préparation des extraits cellulaires à partir des échantillons fournis, jusqu’à l'analyse statistique et bio-informatique des résultats. La plateforme effectue une veille technologique permanente pour offrir des méthodes d’analyse toujours plus performantes. Elle est reconnue pour ses compétences en préparation et analyse de cellules sanguines normales et pathologiques.

Localisée au sein de l’Université Paris Descartes, orientée santé et à proximité de centres hospitaliers d’envergure, la plateforme 3P5 s’adresse aux équipes de recherche fondamentale, mais aussi biomédicale et clinique. Chaque année, elle réalise également plusieurs études pour des sociétés privées à but lucratif.

Expertises et services

Analyse protéomique quantitative globale par marquage isotopique (ITRAQ, SILAC, diméthylation),
Analyse protéomique quantitative globale sans marquage (label free ou LFQ), relative classique ou absolue (exclusivité 3P5) selon le modèle ou le tissu étudié,
Analyse protéomique quantitative globale par électrophorèse 2D (méthode globale),
Analyse protéomique ciblée par recherche de partenaires de molécules appâts : analyse simple d’interactomes (affinity purification-MS) et analyse de protéines d’intérêt couplées aux données issues de l’analyse LFQ globale,
Mesure de la néosynthèse et de la stabilité de protéines par marquage SILAC dynamique,
Analyse de sécrétomes et nanovésicules,
Recherche de modifications post-traductionnelles (acétylations, phosphorylations, ponts disulfures) selon la question posée et la relation ou non avec les analyses globales ou ciblées sur une protéine,
Conseil et développement en purification et micro-analyse de protéines par nLC-MS/MS,
Identification de protéines en solution, sur filtre, ou contenues dans des gels d’acrylamide,
Analyse de constantes d’interaction par biolayer interferometry,
Analyse quantitative ciblée (MRM, PRM),

Moyens et équipements

Analyse protéomique par spectrométrie de masse :

Orbitrap Velos ETD couplé à une chaîne de nanochromatographie U3000 RSLC Thermo,
2 Q-Exactive Plus couplés à une chaîne de nanochromatographie U3000 RSLC Thermo,
Orbitrap Fusion couplé à une chaîne de nanochromatographie U3000 RSLC Thermo,
Triple quadripôle TQS Xevo Waters (partagé avec l’hôpital Necker),
MALDI-TOF-TOF 4800 AB Sciex.

Séparation électrophorétique :

Sur gel 1D ou 2D : méthode DIGE, 2D western blot,
Hors gel sur 12 à 24 fractions : Agilent OFFGEL Fractionator.

Séparation chromatographique :

Séparation analytique en C18 acide,
Séparation semi-préparative,
Séparation off-line en C18 basique,
Colonnes fabriquées à façon par mise à disposition de matériel de packing pour les équipes labellisées Cancéropôle.

Analyse et caractérisation de protéines :

Appareil Octet de mesure par biolayer interferometry,
MALDI-TOF-MS pour les analyses de contrôle (pureté, synthèse, clivage enzymatique).

<hr>Laboratoire de préparation des échantillons pour la digestion enzymatique de protéines en peptides.

<hr>Paillasse de conditionnement des échantillons après digestion enzymatique et avant injection en nano-LC-MS.

$<hr>Plateau de la station ProBot dédiée à la collecte de fractions chromatographiques et leur dépôt sur cibles MALDI.$ <hr>Chaîne d'analyse nano-LC-ESI-MS pilotée par informatique.

<hr>Chaîne d'analyse nano-LC-ESI-MS pilotée par informatique.

<hr>Dispositif automatisé de prélèvement d’échantillons par le chromatographe à ultra-haute performance.

<hr>Dispositif d'électronébulisation (source ESI) permettant la formation d’ions issus de la chromatographie liquide et leur « inspiration » par le spectromètre.

<hr>Aiguille d’ionisation nano-ESI nébulisant la sortie de chromatographie (à droite) vers l’entrée du spectromètre (à gauche).

Comment soumettre un projet ?

Prenez contact avec la plateforme 3P5, de préférence par mail à l’adresse proteomique-3p5@parisdescartes.fr, et décrivez brièvement votre projet. S’il est jugé réalisable, un entretien vous sera proposé dans un délai généralement inférieur à trois semaines, pour exposer le projet au responsable scientifique de la plateforme et à un responsable technique. Les délais et coûts de réalisation seront précisés lors de cette réunion.

Une fiche-projet résumant la demande et précisant les moyens mis en œuvre sera rédigée par 3P5 pour validation par les deux parties. L’équipe demandeuse prendra en charge les expérimentations nécessaires à la production des échantillons, qu'elle enverra à la plateforme avec la fiche-projet signée. Une charte régit les modalités d’exécution et d’échange des données. Quel que soit le cadre des travaux (collaboration ou prestation de service), chaque projet fait l’objet d’une facturation pour participation aux frais d’exécution.

Exemple d'utilisation

Analyse protéomique globale en valeur absolue (nombre de copies protéine/cellule)

La plateforme 3P5 a mis en place une technique d’analyse label free pour réaliser des quantifications relatives et absolues. Cette méthode a permis d’identifier plus de 7 500 protéines et d’en quantifier plus de 6 100 au cours de la différenciation érythroïde humaine, depuis le stade de progéniteur engagé, BFU-E, jusqu’au dernier stade de la différenciation avant énucléation. C’est une avancée majeure dans l’étude et la compréhension de ce mécanisme de différenciation qui met en évidence l’expression de nouveaux acteurs de l’érythropoïèse humaine.

Par implémentation de la quantification absolue globale à l’aide d’un étalon interne présent dans la plupart des cellules, les histones, la gamme d’expression des protéines au cours de la différenciation érythroïde a pu être mesurée en nombre de copies par cellule. Elle s’étend sur 7 logs, allant de protéines exprimées en quelques dizaines de copies, jusqu’à plusieurs centaines de millions de copies par cellule pour les hémoglobines. La plateforme 3P5 a depuis transposé cette technique aux globules rouges circulants, en utilisant cette fois l’hémoglobine ou la bande 3 comme étalon interne.

Pour en savoir plus : Gautier E.-F. et al. (2018). Absolute proteome quantification of highly purified populations of circulating reticulocytes and mature erythrocytes. Blood Advances, 2(20):2646-2657.